телефон: +7 (495) 772 0358
Запись на консультацию:
телефон: +7 (499) 324 9721 - с 900 до 1700
Online-форма записи - круглосуточно
Запись на консультацию:
телефон: +7 (499) 324 9721 - с 900 до 1700
Online-форма записи - круглосуточно
| телефон: +7 (495) 772 0358 Запись на консультацию: телефон: +7 (499) 324 9721 - с 900 до 1700 Online-форма записи - круглосуточно |
   Вирусы - часть 13. Лабораторные анализы при диагностике вирусных инфекций  Лабораторная диагностика вирусных инфекцийНесмотря на разнообразие современных методов лабораторной диагностики вирусных инфекций, основными из них по-прежнему остаются:
Серологические анализы в диагностике вирусных инфекций Диагностическим критерием острой вирусной инфекции обычно служат более чем четырехкратное увеличение титра антител к вирусным антигенам и изменение класса специфических иммуноглобулинов с IgM на IgG в парных сыворотках, взятых в острой стадии заболевания и во время выздоровления.
Анализ на титр противовирусных антителДля выявления антител к определенному вирусу чаще всего используют реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Последний анализ основан на взаимодействии сывороточных антител с вирусными антигенами в зараженных вирусами фиксированных клетках. В реакциях гемадсорбции и гемагглютинации используется блокирующая способность сывороточных антител к гемагглютининам РНК-содержащих вирусов, что приводит к угнетению вызываемой вирусом адсорбцию или агглютинацию эритроцитов.
Иммуноферментный анализШирокое применение находит иммуноферментный анализ – ИФА (ELISA), основанный на использовании специфических вирусных белков, выделенных из зараженных клеток или полученных методом генной инженерии. Вирусные антигены сорбируют на стенках пластиковых ячеек и инкубируют с исследуемой сывороткой. После отмывания несвязавшихся белков в ячейки добавляют так называемые вторые антитела – ковалентно связанные с ферментом (обычно пероксидазой или ЩФ) антитела к IgM или IgG человека. Избыток вторых антител отмывают, а количество связавшихся, зависящее от количества противовирусных антител в сыворотке, оценивают по интенсивности ферментативной цветной реакции. ИФА поддается автоматизации. Это более чувствительный и менее трудоемкий анализ, чем иммунофлюоресценция, гемагглютинация и гемадсорбция.
ИммуноблоттингИммуноблотинг позволяет одновременно выявлять антитела к нескольким вирусным антигенам. Для этого смесь антигенов, разделенных с помощью электрофореза и перенесенных на адсорбирующую мембрану, инкубируют с сывороточными антителами. С помощью этого анализа также можно оценить степень специфичности антител сыворотки, сравнив интенсивность реакции с вирусными и клеточными антителами. Иммуноблоттинг – высокочувствительный и высокоспецифичный анализ, но он не подходит для массовых исследований и его результаты трудно оценить количественно.
Выделение вируса в культуре клетокДругой метод диагностики основан на выделении вирусов в культуре клеток. Размножаясь в культуре клеток, вирусы нередко оказывают цитопатическое действие, видимое под световым микроскопом. Например, размножение вируса простого герпеса в культуре клеток почек кролика вызывает характерное цитопатическое действие в течение трех дней.
В других случаях цитопатическое действие вирусов позволяет поставить лишь предварительный диагноз, который подтверждают путем иммунофлюоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител к данному вирусу.
Вирусы, выделенные в культуре клеток, идентифицируют также с помощью реакции гемадсорбции, методом интерференции (например, клетки, зараженные вирусом краснухи, приобретают устойчивость к цитолитическому действию ЕСНО-вирусов) или с помощью электронной микроскопии (при условии, что при световой микроскопии видны изменения клеточной морфологии).
Эффективность и скорость идентификации вирусов увеличиваются при сочетании кратковременного культивирования с иммунологическими методами. Для обнаружения вируса в однослойной культуре клеток, растущей на покровном стекле, можно использовать моноклональные антитела к специфическому раннему вирусному белку. Таким образом, зараженные клетки удается выявить в течение нескольких часов или суток после заражения – то есть до того, как вирус пройдет несколько циклов репродукции, необходимых для появления видимого цитопатического действия.
Для эффективного выделения вируса в культуре важно правильно собрать материал и быстро перенести его в лабораторию в подходящей среде. Это обеспечивает сохранение жизнеспособности вирусов и ограничивает размножение бактерий и грибов. Вирусы, покрытые липидсодержащей внешней оболочкой, гораздо более чувствительны к замораживанию и оттаиванию по сравнению с вирусами, состоящими только из нуклеокапсида.
Способ взятия материала для анализа на вирусы определяется патогенезом вирусной инфекции.
Вирусы, вызывающие респираторные заболевания, легче всего выделить из содержимого носоглотки, трахеи или бронхов; мокрота для этих целей малопригодна из-за вязкости и загрязнения бактериями, что может вызвать гибель клеточной культуры.
Вирусы простого герпеса и varicella-zoster обычно выделяют из везикулярной жидкости.
Содержимое носоглотки и кал используют в тех случаях, когда лихорадка и сыпь позволяют заподозрить энтеровирусную инфекцию.
При геморрагическом цистите аденовирусы выделяют из мочи.
Цитомегаловирусы выделяют из мочи или лейкоконцентрата.
Если вирус поражает внутренние органы (например, при энцефалите, вызванном герпесвирусами, или аденовирусной пневмонии), для его выделения используют анализ биопсийного материала.
В отличие от серологических реакций, культивирование не позволяет установить время возникновения первичной инфекции. Многие вирусы постоянно или временно заселяют слизистые у здоровых людей. Так, герпесвирусы нередко выделяют из слюны, а в 1% образцов мочи, взятых у здоровых людей, обнаруживают цитомегаловирусы. Наибольшее диагностическое значение имеет выделение вирусов из крови, СМЖ и анализ биопсийного материала.
Прямое определение вирусных антигеновМетод прямого определения вирусных антигенов предназначен для быстрой диагностики вирусных инфекций. Зараженные вирусом клетки, полученные непосредственно от больного, выявляют с помощью моноклональных антител к вирусным антигенам. Так выявляют, например, клетки эпителия носоглотки, зараженные вирусами – возбудителями ОРЗ. Диагностическая ценность пробы Цанка (микроскопическое исследование соскоба со дна везикулы с целью выявления гигантских многоядерных клеток при герпесе и опоясывающем лишае) значительно повышается при окраске мазков с помощью моноклональных антител к вирусу простого герпеса или вирусу varicella-zoster. Моноклональные антитела применяют и для специфического окрашивания гистологических препаратов.
Развитие молекулярно-генетических методов открывает новые возможности в лабораторной диагностике вирусных инфекций. Эти методы позволяют обнаружить ничтожно малое количество вирусной нуклеиновой кислоты в исследуемом материале, отличаются чувствительностью, быстротой и не зависят от жизнеспособности выделенного вируса и его способности к репродукции. Например, при исследовании СМЖ больных герпетическим энцефалитом чувствительность метода, основанного на ПЦР, существенно выше, чем чувствительность выделения вируса в культуре. Однако крайне высокая чувствительность данного метода может привести к ложноположительным результатам из-за загрязнения пробы. Поэтому перед внедрением в клиническую практику молекулярно-генетические методы требуют стандартизации, а их клиническая пригодность должна систематически оцениваться.
Согласно недавним исследованиям, определяемая с помощью ПЦР концентрация вирусной РНК в крови – хороший показатель развития ВИЧ-инфекции, а также появления устойчивых штаммов ВИЧ. К недостаткам молекулярно-генетических методов относится их высокая стоимость.
Анализы при диагностике вирусных инфекцийНиже приведены анализы, которые в практической работе применяются наиболее широко при диагностике вирусных инфекций:
Анализы на инфекции, вызванные вирусами простого герпесаВ лабораторной диагностике инфицированности ВПГ-1 и ВПГ-2, оценке восприимчивости к первичной инфекции, выявлении первичной и острой инфекции используют серологические методы (анализы на определение в сыворотке разных классов антител к ВПГ-1 и ВПГ-2), анализы на обнаружение герпесвирусной ДНК ПЦР-технологиями и другие специальные анализы.
Анализ на антитела класса IgG к вирусу простого герпеса I и II типов – Anti-HSV-IgG HSV-1, 2Определяемые в этом анализе антитела, свидетельствуют о предшествующей или текущей инфекции вирусом простого, герпеса 1 или 2 типов.
Специфические IgG появляются обычно через 10 – 14 дней после проникновения вируса простого герпеса в организм и сохраняются длительное время и пожизненно (серопозитивность). Не обеспечивают стерильного иммунитета и стойкой защиты от реактивации инфекции. Anti-HSV-IgG скорее являются маркером инфицированности организма вирусом простого герпеса, чем показателем стойкого иммунитета к нему. Их наличие в крови отмечается у подавляющего большинства населения. Отсутствие anti-HSV-IgG говорит об отсутствии инфекции вирусами простого герпеса 1 и 2 типов в прошлом и потенциальном риске первичной инфекции в будущем.
Недавняя первичная инфекция и реактивация герпетической инфекции характеризуются достоверным приростом anti-HSV-IgG в пробах, взятых в динамике за 2-недельный период. Рецидивирующий герпес обычно протекает на фоне высоких показателей IgG.
Показаниями к назначению анализа на антитела класса IgG к вирусам простого герпеса 1 и 2 (Anti-HSV-IgG) типов являются:
Материал для анализа: сыворотка крови.
Единицы измерения: индекс позитивности (отношение к пороговому значению). Референсные значения: < 0,9 индекса позитивности.
Интерпретация результатов анализа:
Значения превышают референсные:
Показатели анализа в пределах референсных значений:
Анализ на антитела класса IgM к вирусу простого герпеса I и II типов – Anti-HSV-IgM HSV-1, 2Определяемые в этом анализе антитела класса IgM являются маркером первичного инфицирования вирусом простого герпеса. Антитела IgM к вирусу герпеса - преимущественно маркер первичной инфекции. Однако они также могут быть обнаружены у 10-30% людей с реактивацией старой инфекции. В крови их можно определить на 4-6 день после инфицирования. Максимальные значения достигаются на 15-20 сутки, сохраняются в организме человека недолго (1-2 месяца). Диагностическое значение при первичном инфицировании вирусом герпеса имеет выявление IgM и/или четырехкратное увеличение уровня специфических IgG в парных сыворотках крови, полученных от пациента с интервалом в 2 недели. Рецидивирующий герпес обычно протекает на фоне высоких показателей IgG, свидетельствующих о постоянной антигенной стимуляции организма. Появление IgM у таких пациентов является признаком обострения болезни.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: сыворотка крови.
Единицы измерения: качественный тест.
В случае обнаружения anti-HSV-1/2 IgM антител выдается ответ «положительно», при их отсутствии «отрицательно».
Интерпретация результатов анализа:
Положительный результат: острая инфекция, либо – реактивация вируса.
Отрицательный результат:
Анализ на ДНК вируса простого герпеса II типа – (HSV-2 DNA) в соскобе эпителиальных клетокЭтот анализ позволяет провести качественное определение ДНК вируса простого герпеса II типа (генитального) методом полимеразной цепной реакции.
Аналитические показатели: выявление ДНК герпесвируса в клинических образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Специфичность определения – 100%.
Чувствительность определения – не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробы.
Показания к назначению анализа:
Материал для проведения анализа: соскоб эпителиальных клеток из уретрального и цервикального каналов, с трещин, ранее пораженных мест (с границы пораженной и здоровой ткани), клетки периферической крови.
Анализ на ДНК вируса простого герпеса I типа – (HSV-1 DNA) в кровиЭтот анализ позволяет провести качественное определение ДНК вируса простого герпеса I типа - губного или лабиального - методом полимеразной цепной реакции.
Аналитические показатели: выявление ДНК герпесвируса I типа в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определяемый фрагмент – участки последовательности гена рецепторного белка герпесвируса.
Специфичность определения – 98%.
Чувствительность определения - не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробы.
Показания к назначению анализа:
Материал для исследования: венозная кровь (с ЭДТА).
Анализ на ДНК вируса простого герпеса II типа – (HSV-2 DNA) в кровиЭтот анализ позволяет провести качественное определение ДНК вируса простого герпеса II типа - генитального - методом полимеразной цепной реакции.
Аналитические показатели: выявление ДНК герпесвируса II типа в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определяемый фрагмент – участки последовательности гена рецепторного белка герпесвируса.
Специфичность определения – 98%.
Чувствительность определения – не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробы.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: венозная кровь (с ЭДТА).
Анализ на ДНК вируса герпеса человека VI типа – (HSV-6 DNA) в кровиЭтот анализ позволяет провести качественное определение ДНК вируса человеческого герпеса VI типа - (Human herpes virus VI) методом ПЦР.
Аналитические показатели: выявление ДНК герпесвируса в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определяемый фрагмент – участки последовательности гена рецепторного белка герпесвируса VI типа.
Специфичность анализа – 98%.
Чувствительность анализа – не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробы.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: венозная кровь.
Анализы на инфекции, вызванные цитомегаловирусомВ целях выявления возможной инфицированности организма цитомегаловирусом, оценки риска возникновения острой инфекции, распознавания первичной инфекции целесообразно использование анализов на: anti-CMV-IgG и anti-CMV-IgM в сыворотке крови, анализ на определение вирусной ДНК методом ПЦР.
Анализ на антитела класса IgG к цитомегаловирусу – Anti-CMV-IgGЭтот анализ позволяет определить маркер инфицированности организма и наличия специфических антител к цитомегаловирусу.
Анализ крови на anti-CMV-IgG позволяет установить, был ли человек в прошлом инфицирован цитомегаловирусом. Содержание этих антител обычно быстро нарастает в первые недели острой инфекции и у отдельных лиц может сохраняться на высоком уровне неопределенно долго. Иммунитет, развивающийся по отношению к цитомегаловирусу после инфицирования, не является стерильным: присутствиеanti-CMV-IgG не обеспечивает полной защиты от возврата инфекции. Наличие этих антител говорит о текущей или прошлой инфекции и не исключает возможности ее реактивации в будущем. Отсутствие anti-CMV-IgG свидетельствует об отсутствии инфицирования цитомегаловирусом в прошлом и потенциальной возможности первичного инфицирования и острой CMV-инфекции в будущем (важно для беременных женщин при пересадке органов и проведении иммуносупрессивной терапии).
Серийные анализы уровня anti-CMV-IgG используют в случае необходимости подтверждения первичного или острого течения инфекции, параллельно анализу на anti-CMV-IgM (для этих состояний характерен достоверный прирост уровня anti-CMV-IgG за 2 недели).
Для определения инфицированности новорожденных анализ на антитела класса IgG к цитомегаловирусу – anti-CMV-IgG неинформативно, поскольку специфические IgG, в отличие от IgM, могут передаваться плоду от матери через плаценту.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: сыворотка крови.
Единицы измерения: Ед/мл.
Референсные значения: < 15 Ед/мл.
Интерпретация поулченных результатов анализа:
Повышение значений: предшествующее или текущее инфицирование цитомегаловирусом. Потенциальная способность к передаче инфекции.
В пределах референсных значений:
Анализ на антитела класса IgM к цитомегаловирусу – Anti-CMV-IgMЭтот анализ позволяет определить маркер первичной инфекции цитомегаловирусом и ее реактивации.
Anti-CMV-IgM антитела выявляются как при первичной инфекции, так и при ее реактивации. Поэтому положительный результат в анализе anti-CMV-IgM, полученный при общем скрининговом обследовании, без клинических симптомов или известного факта экспозиции к вирусу не может быть единственным основанием для диагноза первичной инфекции. Инкубационный период при инфицировании организма цитомегаловирусом колеблется от 15 дней до 3 месяцев.
Отрицательный результат анализа на anti-CMV-IgM антитела может быть обусловлен слишком ранней стадией инфекции, когда их содержание еще низкое. Начиная со второго месяца острого процесса уровень IgM антител постепенно снижается и достигает минимума на десятом месяце после инфицирования. Может наблюдаться персистирование anti-CMV-IgM до 18 месяцев после первичной инфекции. В случае реинфекции другим штаммом цитомегаловируса уровень IgM может вновь на время повыситься. При эндогенной реактивации инфекции IgM-антитела образуются обычно в довольно низких концентрациях и могут не обнаруживаться или вообще отсутствовать.
Ограничения анализа:
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: сыворотка крови.
Единицы измерения: качественный тест. В случае обнаружения anti-CMV-IgM антител выдается результат "положительно", в случае их отсутствия - "отрицательно".
Интерпретация результатов анализа:
Положительный результат: Первичное инфицирование или реактивация инфекции. При беременности - внутриутробная инфекция возможна.
Отрицательный результат:
Анализ на ДНК цитомегаловируса в соскобе эпителиальных клеток CMV DNAАнализ позволяет провести качественное определение ДНК цитомегаловируса.
Аналитические показатели: выявление ДНК цитомегаловируса в эпителиальных клетках методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определяемый фрагмент – гомологичные участки 4 экзона гена MIE Cytomegalovirus белка оболочки цитомегаловируса.
Специфичность определения – 100%.
Чувствительность определения – не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробе.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: соскоб эпителиальных клеток из уретрального и цервикального каналов, моча, клетки периферической крови, слюна, мокрота, смывы с бронхов, лаважная жидкость, ликвор, биоптаты.
Анализ на ДНК цитомегаловируса в крови CMV DNAАнализ позволяет провести качественное определение ДНК цитомегаловируса в сыворотке крови.
Аналитические показатели: выявление ДНК цитомегаловируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в сыворотке крови.
Определяемый фрагмент – гомологичные участки белка оболочки цитомегаловируса; специфичность определения 100%.
Чувствительность определения – не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробе.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: венозная кровь.
Анализы на инфицирование вирусом Эпштейна-БаррАнализ на определение ДНК вируса Эпштейна-Барр (EBV DNA)Анализ позволяет провести качественное определение ДНК вируса Эпштейна-Барр методом ПЦР.
Аналитические показатели: выявление ДНК вируса Эпштейна - Барр (ЭБВ, герпесвируса человека IV типа) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в плазме крови.
Определяемый фрагмент – уникальная последовательность ДНК гена рецепторного белка вируса Эпштейна - Барр.
Специфичность определения – 98%.
Чувствительность определения – не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл пробы.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: венозная кровь.
Анализы на Папилломавирусную инфекциюНекоторые из типов вирусов папилломы человека являются факторами высокого онкогенного риска. Более 90% всех цервикальных карцином позитивны к присутствию вируса папилломы человека. Наиболее часто в материале из опухолей шейки матки обнаруживаются 16 и 18 типы. Вирусы папилломы человека типа 6 и 11 считают этиологическим фактором рецидивирующего респираторного папилломатоза, поражающего носоглотку, трахею, гортань, который может прогрессировать и стать распространенным бронхопульмональным заболеванием. Доброкачественный папилломатоз может трансформироваться в плоскоклеточную карциному. Обнаружение в исследуемом материале вируса папилломы человека не говорит о наличии злокачественного процесса, но требует дополнительного гистологического исследования и динамического наблюдения.
Анализ на ДНК вируса папилломы человекаЭтот анализ является общим тестом на качественное выявление вирусов папилломы человека следующих типов: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 43, 44, 45, 52, 54, 56, 58, 59, 66 - методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Аналитические показатели: для выявления ДНК вируса папилломы человека в соскобе эпителиальных клеток методом ПЦР.
Определяемый фрагмент – уникальная последовательность ДНК (L-1 область вирусного генома).
Специфичность определения -100%.
Чувствительность определения - не менее 50 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробы.
Эффективность обнаружения ДНК вируса папилломы человека методом ПЦР – 98%.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: соскоб эпителия с поверхности разрастаний и изъязвлений.
Хранение материала анализа: Если время транспортировки биоматериала с момента его взятия до доставки в лабораторию составляет более двух часов, то пробирку с соскобом необходимо заморозить при -20°С и перевозить в контейнере с хладагентом.
Анализ на определение ДНК вирусов папилломы человека 16 и 18 типов (HPV-16,18)Анализ позволяет провести качественное определение ДНК вирусов папиллом 16 и 18 типов методом ПЦР.
Аналитические показатели: выявление ДНК вируса папиллом человека 16 и 18 типа (папилломы высокого онкогенного риска) в соскобе эпителиальных клеток, определения генотипа вируса методом ПЦР.
Определяемый фрагмент – уникальная последовательность ДНК (L-1 область вирусного генома папилломы человека).
Специфичность определения – 100%.
Чувствительность анализа – не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробы.
Эффективность обнаружения ДНК вирусов папилломы человека методом ПЦР – 98%.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: соскоб эпителия с поверхности разрастаний и изъязвлений.
Анализ на определение ДНК вирусов папилломы человека 31, 33, 35, 16, 18 типов (HPV-31,33,35,16,18)Анализ позволяет провести качественное определение ДНК вирусов папиллом 31, 33, 35, 16, 18 типов.
Аналитические показатели: выявление ДНК вируса папиллом человека типа высокого онкогенного потенциала в соскобе эпителиальных клеток методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определяемый фрагмент – уникальная последовательность ДНК (L-1 область вирусного генома папилломы человека).
Специфичность определения – 100%.
Чувствительность определения – не менее 50 вирусных частиц в 5 мкл пробы.
Эффективность обнаружения ДНК вирусов папилломы человека методом полимеразной цепной реакции – 98%.
Показания к назначению анализа:
Материал для анализа: соскоб эпителия с поверхности разрастаний и изъязвлений.
Запись на консультацию:
телефон: +7 (499) 324 9721 - с 900 до 1700
Online-форма записи на консультацию - круглосуточно
|
||||||||
| ||||||||
